血漿HDL-Ch含量的測(cè)定(肝素-Mn法)

 目的

1、掌握測(cè)定血漿HDL—膽固醇的原理及方法

2、了解血漿HDL—膽固醇臨床意義，進(jìn)一步加深對(duì)脂蛋白結(jié)構(gòu)與代謝有關(guān)內(nèi)容的理解

原理

高密度脂蛋白是血漿脂蛋白的一種，起初由肝臟和小腸合成，分泌至血液循環(huán)時(shí)呈圓盤狀稱為新生HDL。在循環(huán)中或組織細(xì)胞中LCAT(磷脂酰膽堿—膽固醇脂?；D(zhuǎn)移酶)的催化下，新生的HDL與其它脂蛋白相互作用，使顆粒表面的膽固醇接受磷脂轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移來(lái)的脂酸轉(zhuǎn)變?yōu)槟懝檀减?，此非極性的膽固醇酯進(jìn)入疏水核心，使盤狀的HDL逐漸轉(zhuǎn)變成球形的成熟的HDL。HDL不僅能與其它脂蛋白互相作用轉(zhuǎn)移其組成成分，而且能將組織細(xì)胞的膽固醇運(yùn)輸?shù)礁闻K而排泄(或變成膽酸而排泄)。HDL是由蛋白質(zhì)、磷酯、膽固醇、甘油三酯按一定比例組成的。大量流行病學(xué)研究表明，血漿HDL水平與冠心病的發(fā)病率呈負(fù)相關(guān)，高水平HDL有利于預(yù)防冠心病的發(fā)生。

一定濃度的肝素—Mn混合液在一定條件下可選擇性地使血漿中VLDL及LDL沉淀起來(lái)，而HDL仍留在上清液中，從而使HDL與LDL及VLDL分開。HDL中含有一定的膽固醇。利用膽固醇的類脂性質(zhì)，可用有機(jī)溶劑進(jìn)行抽提，然后取一定量抽提液蒸干，加入冰醋酸，利用Zak氏三氯化鐵顯色法，使溶解于冰醋酸中的膽固醇在硫酸存在的條件下與高鐵離子作用，產(chǎn)生穩(wěn)定的紅色物質(zhì)。此物質(zhì)在560nm波長(zhǎng)有最大吸收，可作定量分析。

試劑

1、標(biāo)準(zhǔn)膽固醇液：

a. 貯存液(1000μg/ml)：準(zhǔn)確稱取膽固醇標(biāo)準(zhǔn)100mg溶于100ml三氯化鐵冰醋酸溶液中。

b. 應(yīng)用液：(80μg/ml)：取貯存液4ml加三氯化鐵冰醋酸至50ml。

2、三氯化鐵冰醋溶液：

a. 貯存液(125mg/ml)：取1.25克三氯化鐵溶于100ml冰醋酸中

b. 應(yīng)用液(1mg/ml)：取貯存液2ml加冰醋酸至250ml

3、濃H₂SO₄(要求AR)

4、丙酮—乙醇混合液(按1：1比例配制V/V)

5、肝素—Mn混合液

a. 1.06mol/L氯化錳液(MnCl₂·4H₂O，MW198)：取209.9克MnCl₂·4H₂O溶于1000mlH₂O中

b. 肝素液(280mg/ml)：取肝素280mg溶于1.0ml水溶液中。

c. 肝素—Mn混合液：取a液10ml＋b液0.6ml混勻即成。

臨用前配制，放冰箱保存，至多用一個(gè)月。

操作

1、HDL的分離

取干燥離心管一支，取0.5ml血漿加肝素—Mn混合液0.05ml，混勻后室溫靜置10min。放入TDZ5臺(tái)式低速離心機(jī)中，設(shè)定3000轉(zhuǎn)/分離心10min。沉淀部分為VLDL和LDL，而HDL存在于上清液中。

2、HDL—膽固醇的提取(有機(jī)溶劑抽提法)

取肝素—Mn沉淀后的上清液0.1ml，加酮醇混合液2.5ml(快速加入，使沉淀均勻)，放入TDZ5臺(tái)式低速離心機(jī)中，3000 轉(zhuǎn)/分離心5~6min。取上清液2 ml于沸水中蒸干，此為樣品管(沉淀部分為蛋白質(zhì))。

3、膽固醇測(cè)定取短試管三支，按下表操作，注意加H₂SO₄時(shí)需將試管斜置，沿管壁加入

搖勻，60℃水浴10分鐘，560nm比色。記錄吸光度。

計(jì)算公式：

血清HDL—膽固醇(mg％)＝A_樣/A_標(biāo)×C_標(biāo)×K(mg/dl)

K＝(0.5＋0.05)/0.5×(0.1＋2.5)/2×1/0.1×100/1000＝1.1×1.3＝1.43

臨床意義及正常值：

正常人血漿總膽固醇為125~200mg％，HDL中所含的膽固醇占總膽固醇的1/3~1/4，人們常用HDL中膽固醇的含量表示HDL的量。

HDL—膽固醇水平愈高，愈有利于將組織中的膽固醇運(yùn)輸出來(lái)，對(duì)人們健康長(zhǎng)壽十分有益，

長(zhǎng)期堅(jiān)持體育鍛煉者，其血漿HDL膽固醇較一般人為高，冠心病者比一般正常人低，臨床在測(cè)定血脂時(shí)也測(cè)定HDL—膽固醇的含量，對(duì)于診斷冠心病以及觀察治療效果有一定意義。

    本文實(shí)驗(yàn)所使用的TDZ5臺(tái)式低速離心機(jī)（http://belmontfund.com/hexi2012chanpinzhongxin/taishigaosulengdonglixinji/2012-10-18/71.html）系湖南赫西儀器裝備有限公司研發(fā)生產(chǎn)，該款離心機(jī)安全美觀使用；采用TFT大屏幕液晶顯示、觸摸面板；采用全鋼結(jié)構(gòu)，不銹鋼離心腔，堅(jiān)固耐用；采用無(wú)刷變頻電機(jī)，免維護(hù)，無(wú)粉塵污染；提供10組升降速率選擇，可儲(chǔ)存20個(gè)運(yùn)行程序。